НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА - РЕФЕРАТЫ - Хламидиоз. Методы определения/диагностики

Хламидиоз. Методы определения/диагностики

| |

|ХЛАМИДИОЗ - СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ДИАГНОСТИКЕ И ЛЕЧЕНИЮ |

|Цитоскопические методы обнаружения хламидий |

|При цитоскопическом методе одновременно с поиском |

|цитоплазматических клеток-включений Провачека учитывается |

|количество лейкоцитов как показателя воспаления, а также |

|дополнительная информация о наличии сопутствующей |

|бактериальной микрофлоры, дрожжеподобных грибов, трихомонад|

|и т.п. |

|Показания: Острая фаза заболевания. |

|Материалом для исследования служат соскобы из уретры у |

|мужчин и уретры и /или цервикального канала у женщин. |

|Материал берут специальными щеточками или ложечками |

|Фолькмана. Выделения из цервикального канала удаляются |

|ватным тампоном. Щеточка вводится в канал на 1-2 см, |

|вращается 15 секунд . Соскобный материал распределяется на |

|предметном стекле, высушивается на воздухе и фиксируется в |

|метаноле или холодном ацетоне. Наиболее популярна окраска |

|по Романовскому-Гимзе. После окраски препараты |

|просматриваются в световом микроскопе, используя |

|иммерсионный объектив (х90). При этом цитоплазма клеток |

|окрашивается в голубой цвет, ядра в фиолетово-синий, |

|цитоплазматические включения определяются в виде |

|темно-синих или розовых микроколоний на фоне голубой |

|цитоплазмы. На стадии элементарных включения хламидий |

|окрашиваются в розовый цвет, на стадии элементарных телец |

|-в синий. |

|Цитоскопический метод широко доступен, но эффективен лишь |

|при острых формах инфекции, значительно менее эффективен и |

|информативен при хронических формах заболевания При |

|урогенитальном хламидиозе частота обнаружения телец |

|Провачека в соскобах уретры и цервикального канала не |

|превышает 10-12 %. Наличие этих телец подтверждает диагноз |

|хламидиоза, однако их отсутствие не исключает наличие |

|инфекции. |

| |

| |

|Прямая иммунофлюоресценция (ПИФ) |

|Этот метод предусматривает прямое выявление антигенов |

|хламидий. При люминесцентной микроскопии включения хламидий|

|определяются в виде зеленой или желто-зеленой флюоресценции|

|включений на коричнево-оранжевом фоне цитоплазмы клеток |

|Включения могут иметь зернистую гомогенную или смешанную |

|структуру. |

|Показаниями для диагностики хламидийной инфекции этим |

|методом являются: |

|1.Острая фаза заболевания. |

|2.Хроническая фаза заболевания |

|3 Установление этиологии хронического инфекционного |

|процесса урогенитального тракта |

|4. Беременность с отягощенным акушерским анамнезом |

|5. Бесплодие неясного генеза. |

|Диагностическая информативность ПИФ связана с тем, что с ее|

|помощью выявляются не только корпускулярные, но и |

|растворимые антигены хламидий Этот метод не зависит от |

|возможного изменения тинкториальных свойств микроорганизма |

|в процессе заболевания и лечения. ПИФ-метод является |

|важнейшим скриннинговым методом диагностики урогенитального|

|хламидиоза. Его чувствительность и специфичность при |

|использовании моноклональных антител составляет |

|соответственно 65-90% и 85-90%. При оценке результатов |

|следует учитывать, что только показатели внутриклеточной |

|флюоресценции могут оцениваться в качестве положительного |

|результата этого теста при использовании поликлональных |

|антихламидийных антител, при использовании моноклональных -|

|результат считают при наличии 10 ЭТ в поле зрения. |

|Соскобные препараты готовят также, как и для |

|цитоскопических исследований. |

|Выпускают диагностические наборы, содержащие моноклональные|

|антитела для ПИФ, следующие фирмы: Syva, Drfco, Kallastad, |

|Bartrels, Boots celltech, California Integrated |

|Diagnostics, Orion Diagnostica. Реагенты фирм Syva, Difco, |

|Kallastad представляют собой меченные ФИТЦ моноклональные |

|антитела к основному белку наружной мембраны хламидий, а |

|реагенты других фирм - моноклональные антитела к |

|родоспецифическому хламидийному липолисахариду (ЛПС). В |

|России ЗАО “НИАРМЕДИК плюс” при НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН|

|выпускает моноклональные антитела к ЛПС хламидий, которые |

|успешно конкурируют с продукцией иностранных фирм по |

|качеству продукции. Это набор “Хламоноскрин” для |

|определения моноклональных антител к родоспецифическому |

|липополисахаридному антигену и набор “Хламоноскрин-2” для |

|определения моноклональных антител к видоспецифическому |

|белковому антигену хламидий трахоматис. Наборы имеют ФС |

|42-359598 и регистрационное удостоверение Минздрава России |

|93/ 270/ 9 . |

|Моноклональные антитела отличаются друг от друга по |

|вызываемой яркости свечения, постоянству выявляемых форм ЭТ|

|и степени специфичности. Для диагностики хламидий этим |

|методом необходим люминесцентный микроскоп. |

|В целом, метод ПИФ отвечает критериям высокой |

|чувствительности и специфичности, но требует исполнения |

|опытным, компетентным лабораторным работником. |

|Высококвалифицированная экспертная оценка методом ПИФ редко|

|бывает доступной, поэтому средняя чувствительность его |

|снижается. Метод недостаточно чувствителен и для |

|стабильного определения малых количеств ЭТ. К тому же |

|невозможно проверить и отрицательные результаты, и, |

|следовательно, обнаружить среди них ложноотрицательные, что|

|приводит к снижению чувствительности. |

| |

| |

|Иммуноморфологические методы |

|Эти методы основаны на обнаружении антигенных субстанций |

|хламидий в эпителии и других тканях путем обработки |

|препаратов специфическими антителами. Антитела |

|диагностической антихламидийной сыворотки соединены с |

|какой-либо меткой - люминесцирующей (ФИТЦ-антитела) или |

|ферментной (энзим-меченые антитела). |

| |

| |

|Непрямой метод иммунофлюресценциии |

|Непрямой метод иммунофлюресценции применяют в тех случаях, |

|когда нет в наличии ФИТЦ-конъюгата антихламидийных антител.|

|В этих случаях приготовленный тем же методом, что и для ПИФ|

|препарат из клинических проб обрабатывают вначале |

|антихламидийными антителами, полученными путем иммунизации |

|хламидиями овец, кроликов, мышей или других животных, а |

|затем второй сывороткой, специфичной для вида животного, |

|которое было иммунизировано хламидиями. Антитела второй |

|сыворотки конъюгированы с ФИТЦ. Показания к применению и |

|специфичность данного метода совпадают с ПИФ. |

| |

| |

|Диагностика хламидий на культуре клеток МсСоу |

|Одним из лучших, но в то же время наиболее трудоемким |

|является метод диагностики хламидий путем изоляции |

|возбудителя на культуре клеток, обработанных различными |

|антиметаболитами (“золотой стандарт”) Для этой цели обычно |

|используют чувствительную культуру клеток, обработанную |

|циклогексимидом. Чувствительность культурального метода по |

|сравнению с ПЦР составляет 70-80%, но в то же время он |

|превосходит молекулярно-биологические методы диагностики по|

|специфичности. В литературе описаны случаи выявления |

|хламидий трахоматис методом ПЦР при отрицательных |

|результатах культурального теста и наоборот. |

|Показаниями для диагностики хламидийной инфекции этим |

|методом являются: |

|1 Беременность с отягощенным акушерским анамнезом. |

|2. Оценка эффективности проведенного антибактериального |

|лечения. |

|3. Выявление чувствительности и резистентности к |

|антибактериальным |

|препаратам. |

|4. Выявление хламидий у ВИЧ-инфицированных или лиц со |

|вторичными иммунодефицитными состояниями (онкологические |

|больные после проведенных курсов лучевой и химиотерапии, |

|трансплантации костного мозга; лица, получающие |

|иммунодепрессанты; больные вирусным гепатитом и |

|туберкулезом). |

|5. Бесплодие неясного генеза. |

|6. Установление этиологии хронического инфекционного |

|процесса урогенитального тракта. |

|Культуральный посев является референс-методом при оценке |

|эффективности антибактериального лечения. При исследовании |

|биопроб методом ПЦР после курса химиотерапии в некоторых |

|случаях можно получить “ложноположительные с клинической |

|точки зрения” результаты. Это связано с тем, что невозможно|

|однозначно оценить жизнеспособность и патогенность |

|микробной клетки на основании выявления фрагмента ее |

|генома, используя только данные молекулярно-биологических |

|методов. В этом случае при исследовании клинического |

|материала с помощью культурального посева микробные клетки,|

|потерявшие эти важные с клинической точки зрения свойства, |

|не дадут роста в клеточной культуре. |

|Для транспортировки и хранения клинического материала |

|используют специальную питательную среду (транспортная |

|среда). Она разливается в пенициллиновые флаконы по 1 мл и |

|хранится при температуре + 4 ° С (в общей камере бытового |

|холодильника) в течение 2-х месяцев. Состав транспортной |

|среды: среда MEM с добавлением 10% сыворотки крупного |

|рогатого скота и антибиотика гентамицина концентрации 50 |

|мкг/мл . |

|Клинический материал после перенесения в транспортную среду|

|хранится в общей камере холодильника при температуре + 4 ° |

|С и, в течение двух суток должен быть доставлен в |

|лабораторию. |

|Процедура посева |

|1. Обработка однодневной клеточной культуры МсСоу 1% |

|раствором ДЕАЕ декстраном в течение 30 минут. |

|2. Заражение обработанных клеток материалом, полученным от |

|больных. |

|3. Центрифугирование зараженных клеток при 2500 g в течение|

|45 минут. |

|4. Отмывка клеток питательной средой. |

|5. Добавление к клеткам ростовой среды, содержащей |

|циклогексимид. |

|6. Инкубирование клеток в течение двух суток при +36 ° С. |

|7. Обнаружение хламидий в клетках методом прямой |

|иммунофлюоресценции или ПЦР. |

|Реальный срок получения результатов этим методом - семь |

|дней. |

| |

|В настоящее время в литературе растет число сообщений о |

|случаях резистентности хламидий к антибактериальным |

|препаратам (эритромицину, тетрациклину, доксициклину, |

|фторхинолонам). Ценность культурального метода состоит в |

|том, что он является пока единственным методом, позволяющим|

|выбрать антибактериальный препарат для лечения хламидийной |

|инфекции и оценить эффективность антибактериальной терапии.|

| |

|Схема метода выявления устойчивости хламидий трахоматис к |

|антибактериальным препаратам |

|-Хламидийным изолятом, выделенным от больного при посеве, |

|заражают чувствительные клетки. |

|-К зараженным клеткам добавляют ростовую среду, содержащую |

|антибиотик. |

|-Зараженные клетки инкубируют 5 дней при температуре + 36 °|

|С. |

|-Чувствительность хламидий к антибиотику определяется по |

|подавлению инфекции в зараженных клетках. Процедура |

|длительная, занимает по времени две недели. |

| |

| |

|Диагностика Chlamydia trachomatis методом полимеразной |

|цепной реакции |

|Дороговизна, длительность и трудоемкость |

|микробиологического выделения хламидий в культуре |

|существенно затрудняет использование этой процедуры в |

|рутинной лабораторной диагностике. В литературе накоплен |

|обширный клинико-лабораторный опыт по использованию метода |

|ПЦР для выявления хламидий трахоматис. Особое внимание при |

|его использовании следует уделять, без сомнения, вопросам |

|правильной интерпретации получаемых результатов. |

|Экстремально высокие показатели чувствительности и |

|специфичности ПЦР делают эту методику во многом |

|революционной в лабораторной диагностике. Основными |

|мишенями при выявлении хламидий трахоматис являются |

|нуклеотидная последовательность видоспецифической |

|криптической плазмиды, последовательность главного белка |

|внутренней мембраны, рибосомальные гены. |

|Данная реакция представляет собой многократно повторяющиеся|

|циклы синтеза (амплификацию) специфической области |

|ДНК-мишени в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы, |

|дезоксинуклеотидтрифосфатов, соответствующего солевого |

|буфера и олигонуклеотидных затравок-праймеров, определяющих|

|границы амплифицируемого участка. Каждый цикл состоит из |

|трех стадий с различными температурными режимами. На первой|

|стадии при 94 ° С происходит разделение цепей ДНК, затем |

|при 56-58 ° С - присоединение (отжиг) праймеров к |

|комплементарным последовательностям на ДНК-мишени, и при |

|температуре 72 ° С протекает синтез новых цепей ДНК путем |

|достраивания цепей праймеров в направлении 5’ –3’ . В |

|каждом цикле происходит удвоение числа копий |

|амплифицируемого участка, что позволяет за 25-40 циклов |

|наработать фрагмент ДНК, ограниченный парой выбранных |

|праймеров, в количестве, достаточном для ее детекции с |

|помощью электрофореза или альтернативными ему технологиями |

|По сравнению с широко применяющимися иммунологическими |

|тестами ПЦР-диагностика обладает рядом преимуществ: |

|-высокой и регулируемой специфичностью, обусловленной лишь |

|нуклеотидной последовательностью, применяемой в данной |

|диагностической системе; |

|-высокой чувствительностью, позволяющей диагносцировать не |

|только острые, но и латентные инфекции (возможно выявление |

|даже единичных бактерий или вирусов); |

|-химическое сходство всех нуклеиновых кислот позволяет |

|разрабатывать универсальные процедуры для выявления |

|различных инфекционных агентов, |

|-возможностью идентификации возбудителя в течении 4,5-5 |

|часов. |

| |

|Доставка биоматериала в ПЦР-лабораторию производится в |

|холодовом термоконтейнере или термосе со льдом. Важной |

|отличительной особенностью ПЦР-диагностики является |

|относительно низкая стоимость оборудования для проведения |

|анализа, сочетающаяся с универсальностью метода, что |

|позволяет выявлять весь спектр клинически актуальных |

|инфекционных агентов. |

| |

|ПЦР-лаборатория должна быть разделена на зоны (комнаты). |

|Следует иметь не менее двух комнат |

|-пре-ПЦР-помещение, где проводится обработка клинических |

|образцов, выделение ДНК, приготовление реакционной смеси |

|для ПЦР и постановка ПЦР (при наличии условий два последних|

|этапа рекомендуется также проводить в дополнительном |

|отдельном помещении), в этих помещениях запрещается |

|проводить все другие виды работ с инфекционными агентами |

|(микробиологический анализ, ИФА, другие диагностические |

|тесты), ПЦР-диагностика которых проводится в данной |

|лаборатории. |

|-пост-ПЦР-помещение, где проводится детекция продуктов |

|амплификации, в ПЦР-помещении допускается использовать |

|другие методы детекции инфекций, диагностика которых |

|проводится в данной лаборатории. Комнату детекции продуктов|

|амплификации (пост-ПЦР-помещение) следует располагать как |

|можно дальше от пре-ПЦР-помещений. Следует исключить |

|движение воздушного потока из пост-ПЦР-помещения в |

|пре-ПЦР-помещение. |

|В комнате приготовления реакционной смеси и в комнате |

|обработки клинических образцов должны быть установлены |

|ультрафиолетовые лампы, рабочие поверхности в лаборатории |

|должны обрабатываться дезинфицирующими растворами . |

|Показания для диагностики С. trachomatis методом ПЦР |

|1. Острая фаза заболевания |

|2. Хроническая фаза заболевания |

|3. Установление этиологии хронического инфекционного |

|процесса урогенитального тракта. |

|4. Беременность с отягощенным акушерским анамнезом. 5 |

|Бесплодие неясного генеза. |

|6. Контроль эффективности проведенного антибактериального |

|лечения. |

|В случае выявления фрагмента ДНК хламидии трахоматис после |

|курса химиотерапии следует провести культуральную |

|диагностику для исключения “ложноположительного с |

|клинической точки зрения результата”. Если проведение |

|культуральной диагностики невозможно, то необходимо через |

|5-6 недель (полное обновление эпителиального покрова |

|мочеполовых путей) провести повторное исследование методом |

|ПЦР. |

|7. Выявление хламидии у ВИЧ-инфицированных лиц, больных |

|туберкулезом, вирусным гепатитом и со вторичными |

|иммунодефицитными состояними (онкологические больные после |

|курсов химио- и лучевой терапии, трансплантации костного |

|мозга, получающие иммуносупрессивную терапию). |

|В 1991 году компания Хоффман-ла Рош ЛТД получила от |

|компании Cetus права и патенты на использование ПЦР. В этом|

|же году была создан Roche Molecular Systems, занимающийся |

|исключительно вопросами развития и совершенствования ПЦР. В|

|1992 году были внедрены первые стандартизованные |

|тест-системы для клинической ПЦР-диагностики AMPLICOR |

|Chlamydia trachomatis, а в 1993 году начато производство |

|этих тест систем. Многочисленные проведенные исследования |

|показали высокую чувствительность и специфичность данного |

|набора. Это позволило получить данной тест-системе |

|сертификат Food and Drug Administration (FDA) в 1993 году. |

|В 1995 году появился новый набор AMPLICOR Chlamydia |

|trachomatis/Neisseria gonorrhoeae для одновременной их |

|детекции в одной пробирке. В тесте использованы |

|биотинилированные праймеры (СР24/СР27) из криптической |

|плазмиды С. trachomatis. Чувствительность теста составляет |

|10 копий/мл, специфичность 99,6%. Тест-система включает: |

|набор для сбора и транспортировки образцов, набор для |

|выделения ДНК из цервикальных, уретральных образцов и мочи,|

|набор для амплификации и детекции. Все наборы |

|стандартизованы, полностью готовы к использованию, имеют |

|внутренний контроль, систему защиты от контаминации. |

|Научно-производственной фирмой "Литех" при НИИ |

|физико-химической медицины МЗ РФ выпускается набор |

|реагентов "Полимик" в виде трех отдельных наборов для |

|определения соответственно Chlamydia trachomatis, |

|Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealiticum. Каждый набор |

|“Полимик” комплектуется отдельным набором для выделения ДНК|

|из биопроб. Инструкция по применению набора реагентов |

|рекомендована к утверждению экспертной комиссией Комитета |

|по новой медицинской технике МЗ РФ (протокол No 3 от |

|18.03.96 г.) и утверждена Министерством здравоохранения РФ |

|17.05.96 г. (ТУ 9398-405-17253567-96). |

|В состав реакционной смеси набора “Полимик” входит |

|внутренний контроль (рекомбинантная плазмида, содержащая |

|фрагмент-вставку размером 308 н.п.). Этот компонент |

|позволяет контролировать процесс прохождения реакции |

|амплификации, а также тестировать наличие в пробах веществ,|

|ингибирующих ПЦР. Полоса, соответствующая внутреннему |

|контролю, должна проявляться как в положительном и в |

|отрицательном контролях, так и во всех тестируемых пробах. |

|При выделении ДНК из биопробы (“Набор для выделения ДНК”) |

|используется метод экстракции ДНК из клеток хламидий с |

|помощью гуанидина тиоцианата и связывания высвобождающихся |

|нуклеиновых кислот с частицами крупнопористого стекла. Это |

|позволяет оптимизировать условия выделения и подготовки |

|проб для амплификации, а также уменьшить количество |

|манипуляций с образцом. При этом все манипуляции проводятся|

|в одной пробирке. Выход хромосомной ДНК составляет 70-80% |

|по результатам определения числа колониеобразующих единиц |

|клеток Acholeplasma laidlawii (штамм микоплазм, взятый в |

|качестве стандарта) как в случае чистой культуры, так и при|

|добавлении этих клеток к клиническому материалу, не |

|содержащему определяемых инфекционных агентов. |

|После завершения ПЦР продукты амплификации фракционируют |

|методом электрофореза в 1,5% агарозном геле. |

|Анализ результатов диагностики |

|1. В положительном контрольном образце для хламидий |

|выявляется полоса размером 501 н.п. |

|2. В отрицательном контрольном образце полоса, |

|соответствующая фрагментам генома хламидий, должна |

|отсутствовать. Появление полосы в отрицательном контроле |

|свидетельствует о контаминации компонентов набора. |

|3. В анализируемой пробе отсутствие полосы строго на уровне|

|соответствующего контроля свидетельствует об отсутствии |

|возбудителя в пробе, наличие полосы, соответствующей по |

|электрофоретической подвижности положительному контролю, |

|свидетельствует о наличии хламидий в клинической пробе. |

|4. Во всех образцах выявляется полоса оранжево-красного |

|цвета, соответствующая внутреннему контролю размером 308 |

|н.п. Полученные результаты можно документировать |

|фотографированием гелей с использованием оранжевого или |

|интерференционного (594 нм) светофильтра. При использовании|

|видеосистемы "Gel-doc" возможно документирование |

|результатов электрофореза в виде компьютерного файла, |

|доступного любым приложениям “Windows”. |

|Набор “Полимик” следует хранить при температуре - 18-20 ° С|

|в течение всего срока годности (6 месяцев). Допускается, |

|хранение и транспортировка набора при температуре не выше 0|

|° градусов не более одних суток. |

|По состоянию на третий квартал 1999 г. Минздравом России |

|помимо набора “Полимик” разрешены следующие диагностические|

|наборы для обнаружения хламидий трахоматис методом ПЦР в |

|качестве изделий медицинского назначения: |

|набор реагентов амплификационный для определения ДНК |

|хламидий (Хламидия-Ампли-тест) ТУ 9398-402-18137053-96 |

|производства АО “ВНЦМДЛ”, Москва; |

|набор реактивов для выявления нуклеотидных |

|последовательностей хламидия трахоматис методом ПЦР (Хлам |

|Ам) ТУ “9398-403-29032954-96 производства ЗАО “Внедрение |

|систем в медицину”. Москва, |

|набор реагентов для выявления ДНК хламидий трахоматис |

|методом ПЦР (Хлам-Ген) ТУ 9398-412-46482062-97 производства|

|НПФ “ДНК-технология”, Москва. |

| |

| |

|Достоинства и недостатки различных методов обнаружения Chlamydia |

|trachomatis |

|(Taylor-Robinson О., Thomas B.J ,1991, с дополнениями Говорун В.М,|

|Бочкарев Е.Г., Парфенова Т.М., 1999) |

| |

|Характеристика/ Метод |

|ПИФ |

|Культуральный посев |

|ИФА-методы |

|ПЦР |

| |

|Исследуемый материал |

|Любой |

|Большинство |

|Ограничения из-за неспецифичности реакций |

|Любой |

| |

|Значение правильно взятых проб |

|Решающее |

|Решающее |

|Решающее |

|Решающее |

| |

|Условия транспортировки проб |

|Если препарат фиксирован -условия не важны |

|Быстрая доставка или хранение при низкой температуре |

|Не имеет значения, если проба взята в буфер |

|Быстрая доставка или хранение при низкой to менее важно, чем для |

|культуры клеток |

| |

|Условия хранения |

|На короткое время при +4°С длительно при -20 °С |

|+4°С - сутки-двое. Длит хранение в жидком азоте |

|3 -5 дней при +4°С Замораживание снижает чувствительность |

|На короткое время + 4°С, две недели - 20°С Длительное время - в |

|жидком азоте |

| |

|Проверка адекватности взятия материала |

|Мазки оценивают во время тестирования |

|Не практикуется |

|Не практикуется |

|Определяется, присутствует ли ДНК. |

| |

|Потребность в специальном оборудовании |

|Люминесцентный микроскоп |

|Центрифуга |

|Комплект для ИФА |

|Амплификатор и оборудование для электрофореза |

| |

|Обработка проб |

|Простая |

|Трудоемкая |

|Становится проще для новых тестов |

|Требует строгой предосторожности, чтобы не контаминировать ДНК |

| |

|Чтение результатов |

|Субъективное и утомительное |

|Субъективное умеренно утомительное |

|Объективное, Простое |

|Объективное, простое |

| |

|Время выполнения |

|30 минут |

|12-72 часа |

|3 часа |

|4,5-5 часов |

| |

|Способы проверки результатов |

|Повторный просмотр |

|Повторный просмотр |

|Повторение теста |

|Повторная проба или переваривание эндоуклеазой |

| |

|Результат зависит от следующих причин: |

|Опыта микроскописта |

|Чувствительности клеточной культуры |

|Присущей мощности теста |

|Требует хорошего контроля и отсуствия контаминации |

| |

|Способность к поддержанию штамма |

|Нет |

|Да |

|Нет |

|Нет |

| |

|Использование как контроля эффективности лечения |

|Ограничено |

|Рекомендуется |

|Ограничено |

|Рекомендуется с ограничениями |

| |

| |

| |