 |
НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА - РЕФЕРАТЫ - Трансгенные растения как биопродуценты белков медицинского назначения
Трансгенные растения как биопродуценты белков медицинского назначения
Трансгенные растения как биопродуценты белков
медицинского назначения
Успехи
в области генетической инженерии растений открыли новые возможности для
получения рекомбинантных белков. Для этой цели широко используются клетки
бактерий, дрожжей, млекопитающих и насекомых. Однако такие системы имеют ряд
существенных недостатков. В клетках прокариот не происходят посттрансля-ционная
модификация и правильная укладка (фолдинг) полипептидных цепей многих
эукариотических белков. Клетки дрожжей, млекопитающих и насекомых лишены
подобных недостатков, но их использование в качестве биопродуцентов ограничено
высокой себестоимостью выхода рекомбинантных белков (Russel, Clarke, 1999).
По
сравнению с вышеупомянутыми системами экспрессии растения имеют ряд
особенностей и преиму-ществ. Прежде всего необходимо отметить, что в клетках
высших растений происходят гликозилирование и фолдинг белков, сходные с таковым
в клетках млекопитающих. Культивирование растений не требует доро-гостоящего
оборудования, а сельскохозяйственные масштабы продукции гарантируют доступность
реком-бинантного препарата в количествах, достаточных для клинических испытаний
и широкого терапевтического использования. В отличие от животных, растительные
клетки не содержат в своём составе патогенные для человека вирусы, а также
прионы и, таким образом, могут служить безопасным источником рекомбинантных
белков медицинского назначения. Хотя стоимость выделения и очистки целевого
белка из растений-продуцентов может быть сопоставима с таковой для других
систем, наработка сырого материала обходится значительно дешевле. В ряде
случаев, например, при использовании трансгенных растений в качестве
"съедобных вакцин" выделение белка в чистом виде не требуется. В
дополнение ко всему перенос фраг-ментов экзогенной ДНК в растительный геном и
регенерация у растений происходят значительно проще по сравнению с животными
(Daniell et al., 2001).
Известно,
что аппарат транскрипции и трансляции у растений является универсальным и может
быть адап-тирован не только для накопления гомологичных белков, не
синтезируемых данным видом растения, но и для синтеза гетерологичных белков как
бактериального, так и животного происхождения. С другой стороны, сами растения
in vivo могут служить благоприятной средой для развития различных организмов -
бактерий и вирусов, геном которых может быть модифицирован и адаптирован для
синтеза соответствующих гетерологич-ных белков. Анализируя данные литературы, необходимо
отметить, что поиск различных систем для экспрессии чужеродных генов за
последние десять лет был связан с развитием трёх основных подходов.
Первым
из них был предложен путь использования трансгенных растений, в ядерный геном
которых перене-сены гены, контролирующие синтез соответствующих гетерологичных
белков (De la Riva, 1998). Получение таких растений было основано на природной
способности почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens переносить часть своей
собственной ДНК в виде Т-области мегаплазмиды в растительные клетки. Именно эта
часть Ti-плазмиды была использована учёными для переноса генно-инженерных
конструкций, включающих различные целевые гены. В качестве целевых можно было
использовать и гены гетерологичных белков меди-цинского назначения. Необходимо
отметить, что использование только агробактериального переноса в значи-тельной
степени сужало круг растений-реципиентов и ограничивало его, как правило, до
двудольных. Поэтому дальнейшее развитие идеи использования растительного генома
для синтеза гетерологичных белков стимули-ровало поиск новых способов переноса
фрагментов экзогенной ДНК в геном растений. Были разработаны мето-ды прямой
доставки чужеродных генов в растительный геном, такие, как микроинъекции
(Neuhaus et al. , 1987), электропорация (Fromm et al. , 1985) и методы
биобаллистики (Klein et al. , 1987). В этом слу-чае для переноса использовалась
очищенная плазмидная ДНК, в которой содержались генетические конструк-ции с
целевыми генами.
При
переносе в геном растения чужеродные гены, как правило, стабильно интегрируются
и передаются по-томкам в последующих поколениях согласно законам Менделя
(Horsch et al., 1984; Budar et al. , 1986; De-roles, Gardner, 1988;
Heberle-Bors et al. , 1988).
Хотя
идея внедрения экзогенной ДНК в растительный геном для наработки
соответствующих продуктов в растении представляется весьма перспективной, этот
подход не лишен и некоторых недостатков. Среди них не-обходимо отметить низкий
уровень экспрессии перенесенных генов, даже при использовании очень сильных
промоторов. Содержание сывороточного альбумина человека в трансгенных тканях
табака составило 0,02 % от суммарного белка (Sijmons et al. , 1990). Ещё
меньшие значения были получены для эритропоэтина (0,003 %) и b-интерферона
(0,001 %) (Edelbaum, 1992; Kusnadi et al. , 1997). Одной из причин этого,
по-видимому, является увеличение скорости деградации мРНК чужеродно-го гена,
когда её уровень достигает порогового значения. Этот механизм, возможно, служит
одним из способов защиты растения от РНК-содержащих вирусов (Matzke et al. ,
1994; Matzke M., Matzke A., 1995; Vaucheret, 2001). Второй причиной низкого
уровня продукции является протеолиз чужеродных белков в цитоплазме
расти-тельной клетки. Введение в полипептидную цепь целевого белка сигнальных
последовательностей, направляю-щих его накопление в эндоплазматической сети или
секрецию в апопласт, где частота протеолиза значительно ниже, позволяет достичь
повышения продуктивности трансгенных растений в 100 раз (Giddings et al. , 2000;
Menassa et al. , 2001). Экспрессия целевых белков в запасной ткани семян, где
уровень биодеградации ниже, чем в обводнённых тканях (листья, плоды),
способствует повышению продуктивности на 2-3 порядка. Так, содер-жание
химерного энкефалина человека в семенах трансгенного A. thaliana составило 2,9
% от суммарного белка. Этого удалось достичь введением в полипептидную цепь
энкефалина сигнальной последовательности глю-телина (запасного белка риса),
направляющей его транспортировку в компартменты накопления запасных белков.
Химерный ген находился под контролем промотора гена глютелина, который
направлял его тканеспецифичную транскрипцию в клетках запасной ткани семян
(Vandekerckhove et al. , 1989).
Интеграция
чужеродных генов в ядерный геном растения сопряжена и с рядом проблем
биобезопасности использования генетически модифицированных организмов. При
получении трансгенных растений в сель-скохозяйственных масштабах существует
опасность утечки трансгена в окружающую среду (выход из-под контроля) в
результате переопыления с близкородственными дикорастущими видами. Для
повышения уров-ня биобезопасности рядом исследователей было предложено
использовать для трансгенеза стерильные по мужской линии растения (Menassa et
al. , 2001).
Другой
проблемой, возникающей при интеграции гетерологичных генов в ядерный геном
растений, явля-ется вероятность "замолкания" трансгенов в последующих
поколениях (сайленсинг). Вероятность сайлен-синга резко возрастает при
встраивании множества копий чужеродного гена на геном растения (Finnegan,
McElroy, 1994; Matzke et al. , 1994; Matzke М., Matzke А., 1995). Поэтому при
создании трансгенных растений-биопродуцентов рекомбинантных белков среди
трансформантов отбирают растения, содержащие только одну встройку чужеродного
гена.
В
связи с вышеперечисленными проблемами, возникающими при интеграции трансгенов в
ядерный ге-ном, весьма привлекательным представляется способ переноса
экзогенной ДНК в геном хлоропластов. Хлоропласты - органеллы растительной
клетки, содержащие зеленый пигмент хлорофилл, а также ряд дру-гих пигментов,
принимающих участие в поглощении световой энергии и осуществлении
фотохимических реак-ций. По форме и размерам хлоропласты высших растений
достаточно однородны. Некоторая вариабельность наблюдается в отношении их числа
в расчете на одну клетку, которое варьирует от нескольких десятков до сот-ни и
более. Каждый отдельный хлоропласт окружен двойной мембраной и имеет сложную
внутреннюю структу-ру. В одной растительной клетке в среднем содержится от 5 до
10 тыс. копий хлоропластной ДНК, за счёт чего уровень экспрессии чужеродных
белков достигает значений, сравнимых с уровнем экспрессии в E. coli (до 40 % от
суммарного белка клетки) (Staub et al. , 2000; De Cosa et al. , 2001). Однако в
литературе встречаются только единичные работы по получению растений с
генетически модифицированными хлоропла-стами. Это связано с чрезвычайной
сложностью методов их трансформации и последующего отбора.
Третий
путь использования растений для накопления белков гетерологичного происхождения
основан на природной способности растительных вирусов проникать в клетки
растений и колонизировать растительные тка-ни (Mushegian, Shepherd, 1995). На
этой основе возникает реальная возможность модификации вирусного гено-ма и
адаптации его не только в качестве вектора для доставки в растения
соответствующих генетических конст-рукций, но и в качестве матриц для
транзиентной экспрессии генов, кодирующих синтез белков, представляющих
коммерческий интерес. Для заражения растительных тканей используются
рекомбинантные (+)РНК-содержащие вирусы растений, несущие в составе своего
генома транскрипт чужеродного гена (Mushegian, Shepherd, 1995). Скорость
мультипликации вирусной РНК в растениях чрезвычайно высока, за счёт чего
достигается высокая ко-пийность транскриптов чужеродных генов в цитоплазме
заражённых клеток. Поэтому продуктивность вирусной системы экспрессии в среднем
на 2 порядка выше по сравнению со стабильной трансформацией растений (Giddings
et al. , 2000).
В
настоящее время широко используются два вида вирусов для продукции чужеродных
белков в растениях: ви-рус табачной мозаики (ВТМ) и вирус мозаики коровьего
гороха (ВМКГ). Вектор на основе РНК ВТМ использовался для получения ингибитора
репликации ВИЧ α-трихосантина
в Nicotiana benthamiana (Kumagai et al. , 1993). Для этого целевую
последовательность, кодирующую α -трихосантин, поместили под субгеномный промотор белка
оболочки ВТМ. Спустя две недели после заражения рекомбинантный α
-трихосантин накапливался в листьях N. Benthamianaв количестве 2 % от
суммарного белка. На основе ВМКГ удалось получить химерные частицы этого вируса
с экспонированными на поверхности антигенными детерминантами ВИЧ1 (gp41) (Porta
et al. , 1996). Для этого последовательность эпитопа gp41 была
"сшита" с геном белка оболочки ВМКГ. Такие частицы обладали высокой
иммунногенностью и были способны нейтрализовать инфекционные свойства ВИЧ1 in
vivo.
Сравнивая
пути наработки гетерологичных белков в растительных тканях, необходимо
отметить, что каждый из них имеет свои преимущества и недостатки. В трансгенных
растениях перенесенные гены стабильно встраиваются в геном и сохраняются в
последующих поколениях, тогда как при интеграции генов в геном вирусов в
зараженных вирусами растениях обеспечивается их временная (транзиентная)
экспрессия. Накопление соответствующих бел-ковых продуктов будет определяться
периодом вегетации зараженного растения-хозяина. С другой стороны,
пре-имуществом вирусного пути накопления белков в растениях является короткий
период размножения вирусных час-тиц, простота инфицирования растений, а также
широкий диапазон различных видов растений, которые могли бы быть использованы
для этих целей.
Растения-продуценты антител
Цель
иммунизации организма вакцинами - индуцировать продукцию антител на патогенный
агент. Альтерна-тивой такому подходу является метод пассивной иммунизации,
основанный на введении готовых иммуноглобу-линов. Широкое применение такого
подхода долгое время было ограничено высокой стоимостью антител, полу-чаемых
традиционными способами. В 1989 г. была показана возможность сборки
функционально активных им-муноглобулинов класса IgG и IgA из лёгкой и тяжёлой
цепей в растениях табака (Hiatt et al. , 1989). С того момента в нескольких
крупных лабораториях мира были получены трансгенные растения-продуценты
различных типов антител к эпитопам ряда патогенных агентов. В таблице 1
представлена сводка этих результатов.
Таблица
1
Растения-продуценты
антител
|
Применение и специфичность
| | |
|
