НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА - РЕФЕРАТЫ - Исследование бактерий по почвенному профилю дерновой альфегумусовой глеевой почвы
Исследование бактерий по почвенному профилю дерновой альфегумусовой глеевой почвы
Оглавление
Введение
1 Материалы и методы эмпирического исследования
1.1 Объект исследования и подготовка образцов
почв к микробиологическому исследованию
1.2 Определение общей численности бактерий в
почве
1.3 Определение численности сапротрофов и
олиготрофов
2 Результаты и обсуждение исследования
Заключение
Список использованных источников и литературы
Введение
Почва является
основным депо разнообразных микроорганизмов на Земле [1;10]. Известно, что 60–90
% биомассы Земли представлено микроорганизмами, населяющими, главным образом
почву [2], причем их численность в почве, по сравнению с другими природными
средами, выше на несколько порядков [3].
Микроорганизмы
распределяются по всему почвенному профилю вплоть до подстилающей породы [1;10].
Значительный практический и теоретический интерес представляет вопрос о том,
как изменяется численность микроорганизмов по почвенному профилю, а также
динамка численности микроорганизмов в нижнем почвенном горизонте в силу новизны
самой проблемы. Особенно это касается недостаточно исследованных почв, имеющих
в своем профиле оглеенные горизонты.
В анаэробных
условиях при участии гетеротрофных бактерий, использующих органическое
вещество, при постоянном или периодическом увлажнении идет один из интересных
почвообразовательных процессов – глееобразование [2;8]. Этот процесс
сопровождается восстановлением Fe(III) до Fe(II) и выносом Fe(II)-соединений в нижние
горизонты почвенного профиля. Глееобразование практически всюду может
происходить в результате антропогенной деятельности, если она приводит к
переувлажнению почв.
В условиях
застойно-промывного режима в результате глееобразования происходит максимальный
вынос не только железа, но и других металлов – марганца, алюминия, кальция,
магния [8;9]. Изучение особенностей микроорганизмов глеевых почв весьма
актуально, так как при антропогенном воздействии на почвенный покров, в том
числе при загрязнении почвы нефтью и нефтепродуктами, подобные почвы встречаются
практически повсеместно. В Ярославской области почвы с различной степенью
оглеения занимают около 18,3 %, что составляет 662,5 га земель [8].
Почвенные
микроскопические грибы и бактерии являются практически единственными
деструкторами органического вещества, поступающего в почву в виде растительного
опада, мертвых животных, а также органических ксенобиотиков [4;9]. Важным микробиологическим
показателем состояния почвы является соотношение численности бактерий двух
физиологических групп, которые входят в функциональную структуру почвы: сапротрофов
и олиготрофов [2;3]. Сапротрофы разлагают разнообразные органические соединения
в значительной концентрации, попадающие в почву. Олиготрофы способны
ассимилировать органические соединения в условиях их низкой концентрации, при
этом они разлагают остаточные количества органических соединений,
«рассеивающиеся» в почве при деятельности сапротрофов и автохтонных микроорганизмов,
разлагающих почвенный гумус [1;3].
Целью работы было изучение
динамики численности бактерий по почвенному профилю дерновой альфегумусовой
глеевой почвы.
Для решения
данной цели были поставлены следующие задачи:
1.
Определить
общую численность бактерий в 5 горизонтах почвенного профиля дерновой
альфегумусовой глеевой почвы путем прямого счета по методу Виноградского-Брида.
2.
Определить
численность сапротрофных бактерий в каждом горизонте исследуемой почвы.
3.
Определить
численность олиготрофных бактерий в каждом горизонте исследуемой почвы.
4.
Проанализировать
полученные данные по общей численности, численности сапротрофов и численности
олиготрофов.
1 Материалы и методы
исследования
1.1
Объект
исследования и подготовка образцов почвы
к микробиологическому
исследованию
Объектом
исследования служили пять образцов дерновой альфегумусовой глеевой почвы,
отобранной в 5 км от поселка Дорожный Ярославского района Ярославской области.
Охарактеризуем горизонты по мере увеличения глубины их залегания:
1.
почвенный
образец взят из темногумусового горизонта почвенного разреза. Глубина 7 – 12 см, цвет темно-серый, структура зернистая, наблюдается обилие мелких корней;
2.
образец
взят из горизонта темногумусового с признаками оглеения почвенного разреза.
Глубина 12 – 16 см, цвет темно-серый, наблюдаются мелкие серые, рыжие и сизые
пятна, в качестве включений представлены мелкие корни, механический состав определяется
как среднесуглинистый;
3.
образец
взят из светлогумусового горизонта почвенного разреза. Глубина 16 – 23 см, цвет серый, наблюдаются рыжие и сизые пятна, механический состав определяется как
среднесуглинистый, структура зернисто-комковатая, в качестве включений
представлены мелкие корни;
4.
образец
взят из иллювиально-гумусово-железистого горизонта почвенного разреза. Глубина
25 – 45 см, преобладающий цвет светло-бурый с многочисленными охристыми, сизыми
и голубыми затеками и пятнами; до глубины 45 см заметны затеки гумусового вещества; горизонт плотного сложения, сильно увлажнен; механический состав определяется
как легкоглинистый;
5.
образец
взят из глеевого горизонта почвенного разреза. Глубина 45 – 70 см, цвет темно-серый, присутствуют кирпично-красные включения; горизонт более уплотнен, с глубины 70 см просачивается вода.
Подготовку
почвенных образцов проводили согласно существующим рекомендациям [7].
1.
Почву
высыпали на сухое стекло, тщательно перемешивали и раскладывали ровным слоем.
Пользуясь пинцетом, удаляли мелкие корешки и другие посторонние включения. Из
разных мест рассыпанной почвы отбирали небольшие порции и взвешивали на
технических весах по 1 г почвы из каждого горизонта.
2.
Для
разрушения почвенных агрегатов и десорбции клеток микроорганизмов с почвенных
частиц, каждую навеску почвы вносили в отдельную колбу, содержащую 100 мл
стерильного физиологического раствора (0,5% раствор хлорида натрия). Колбы
встряхивали на качалке в течение 30 минут.
1.2
Определение
общей численности бактерий в почве
Общее
количество бактерий в почве учитывали прямым счетом на фиксированных окрашенных
мазках (метод Виноградского-Брида) [6;7].
1.
Пять
предметных стекол обезжиривали и на каждом обводили карандашом по стеклу квадрат
со стороной 15 мм.
2.
Бактериальную
суспензию объемом 0,1 мл из соответствующей колбы наносили на стекло и
равномерно распределяли по площади квадрата.
3.
Препараты
подсушивали на воздухе, фиксировали в пламени спиртовки (проносили над пламенем
2 – 3 раза) и окрашивали 2 минуты фуксином. Краситель сливали, препарат
промывали и высушивали между полосками фильтровальной бумаги.
4.
Подсчитывали
количество клеток, используя световой микроскоп марки «Биолам» с масляной
иммерсионной системой при увеличении 10×1,0×100.
Для прямого
счета микробных клеток вставляли в окуляр микроскопа сеточку Гаженко, 9
маленьких квадратиков которой составляют поле зрения. Просматривали 15 полей
зрения.
Общую
численность бактерий в 1 г почвы (Nобщ.) определяли по формуле:
S × Σni
N общ. = z× s×v ×100 [кл/г], где
S – общая площадь
окрашенного на стекле препарата (225 мм2);
Σni – сумма подсчитанных под
микроскопом микробных клеток;
z – количество просмотренных
полей зрения (15);
s – площадь одного поля
зрения (1089×10-6 мм2);
v – объем образца воды,
затраченный на приготовление окрашенного препарата (0,1 мл);
100 –
разведение первоначального образца почвы в 100 раз.
Опыт
проводили в двухкратной повторности, чтобы рассчитать доверительный интервал.
1.3
Определение
численности сапротрофов и олиготрофов
Определение
количества клеток сапротрофов (Nсапр.) проводили высевом на жидкую
питательную среду – мясо-пептонный бульон (МПБ) [6]. Для приготовления МПБ использовали
стандартную питательную среду (ИЛО «Питательные среды»). Состав МПБ, г/л:
панкреатический гидролизат кильки – 17,9; NaCl – 7,7 ± 0,3; вода
дистиллированная – 1000 мл. Среду стерилизовали автоклавированием 20 мин при 1
атм. Численность определяли при помощи метода наиболее вероятного числа (НВЧ) с
использованием таблиц Мак-Креди [7]. Готовили ряд предельных
десятикратных разведений 1 г почвы. Для посевов использовали разведения от 10-1
до 10-7. Количество посевного материала везде составляло 1 мл, посев
осуществляли в трехкратной повторности. Инкубацию проводили в термостате при 28
0С в течение 7 сут. После инкубации регистрировали рост бактерий,
используя различные показатели: помутнение среды, образование пленки [6;7].
Для выделения олиготрофов использовали среду М2 следующего
состава [11]: Na2HPO4 – 0,8 г; KH2PO4 – 0,5 г; NH4Cl – 0,5 г; MgSO4 – 0,2 г; CaCl2 – 0,1 г; FeSO4×7H2O –15 мг; дрожжевой
экстракт – 0,1 г ; пептон – 0,2 г; агар – 15 г; глюкоза – 0,2 г; вода дистиллированная – 1000 мл. Среду стерилизовали автоклавированием 20 мин при 1 атм. Численность
олиготрофов (Nолиг.) определяли методом высева по Коху [7]. Готовили ряд предельных
десятикратных разведений 1 г почвы в дистиллированной воде: от 10-1
до 10-9. По 1 мл суспензии из каждого разведения вносили в три
параллельные чашки Петри. Все чашки заливали расплавленной средой. Посевы
инкубировали 14 сут., а затем подсчитывали количество колоний, выросших на
каждой чашке и среднее число колоний, выросших из одного разведения. При этом
определяли значимость различий двух повторных определений по критерию χ2,
рассчитываемому по формуле [7]:
(ni – n)2
χ 2 = п ,
где пi – число колоний, выросших
на первой и второй чашках, засеянных из одного разведения; п – их среднее
значение.
Различие
считается значимым при χ 2 не менее 3,841. Пересчет
числа выросших колоний (п) на численность бактерий соответствующей
группы (N) производили исходя из предположения, что одной колониеобразующей
единицей (КОЕ) является отдельная микробная клетка. Для этого использовали
формулу:
n×r
Nолиг. = v [кл/г],
где п
– среднее число колоний на чашках Петри, засеянных из одного разведения; r – величина разведения; v – объем образца,
посеянного на чашку (мл).
Кроме того, рассчитывали
отношение Nсапр. к Nобщ. для каждого горизонта.
2
Результаты
и обсуждение исследования
Результаты начального
этапа микробиологического исследования почвенных образцов представлены в приложении
2 и на рисунке 1.
Таблица
1
Общая
численность бактерий в почвенном профиле
дерновой
альфегумусовой глеевой почвы
Горизонты (расположены от верхнего к нижнему)
|
Численность бактерий, кл/г сухой почвы
|
1.
|
(5,35±0,05)×109
|
2.
|
(6,2±0,1)×109
|
3.
|
(4,8±0,15)×109
|
4.
|
(4,5±0,05)×109
|
5.
|
(3,65±0,1)×109
|
Рис. 1. Динамика общей
численности бактерий в почвенном профиле дерновой альфегумусовой глеевой почвы.
N – численность бактерий
(×
109 кл/г почвы).
Как видно из
табл. 1 и рис. 1, максимальное значение общей численности бактерий (Nобщ.) – 6,2×109
кл/г – наблюдали во втором горизонте, по сравнению с остальными четырьмя
горизонтами. Этот факт можно объяснить тем, что два верхних горизонта
исследуемой почвы обладают хорошей проницаемостью для воды и поступающего с ней
органического вещества. Третий горизонт почвенного профиля уже более уплотнен,
поэтому органическое вещество, накапливаясь во втором горизонте, является
фактором, стимулирующим развитие в нем почвенных микроорганизмов.
Данные табл.
1 показывают, что Nобщ. достоверно снижалась с увеличением глубины залегания почвенного
горизонта: от второго к пятому, самому нижнему. Полученный результат
согласуется с тем фактом, что содержание органического вещества, необходимого
для развития почвенных микроорганизмов, также снижается с увеличением глубины
залегания горизонта. При переходе от верхнего горизонта к нижележащим
изменяются также окислительно-восстановительные условия, pH и др.
Порядок
величин Nобщ. в каждом горизонте был одинаков – 109 кл/г.
По-видимому, в верхних более рыхлых горизонтах, куда поступает достаточное
количество кислорода с поверхности, создались оптимальные условия для развития
аэробных микроорганизмов. В нижележащих горизонтах содержание кислорода
минимально, и прежний порядок значения Nобщ. объясняется активным
развитием анаэробов.
Численность сапротрофных
бактерий (Nсапр.) уменьшалась от первого горизонта к третьему, причем резкое
снижение численности – более чем в 6 раз – было отмечено при переходе от
первого ко второму горизонту (рис. 2А). Nсапр. (таб.2) в четвертом
горизонте – 4,5×104 кл/г – была незначительно выше, по
сравнению с третьим – 2,0×104 кл/г, – тогда как в пятом она
опять понижалось до значения, отмеченного в третьем горизонте (рис. 2А). Как
показано на рис. 2Б, численность олиготрофных бактерий (Nолиг.) последовательно
снижалась с увеличением глубины залегания почвенного горизонта от 9,5×107
в первом до 1,5×107 кл/г в пятом горизонте (таб.2).
Рис.
2. Численность сапротрофов (А) и олиготрофов (Б) в почвенном профиле дерновой
альфегумусовой глеевой почвы. N – численность бактерий (кл/г почвы)
Таблица
2
Численность сапротрофных
и олиготрофных бактерий в почвенном профиле дерновой альфегумусовой глеевой
почвы
Горизонт
|
Сапротрофы
|
Олиготрофы
|
1
|
2,5×105
|
9,5×107
|
2
|
4,0×104
|
7,5×107
|
3
|
2,0×104
|
3,5×107
|
4
|
4,5×104
|
2,0×107
|
5
|
1,4×104
|
1,5×107
|
В общем, Nсапр. находилась на уровне 105 кл/г в
первом, и 104 кл/г в остальных горизонтах (прил. 3). Nолиг. соответствовала 107 кл/г в
каждом горизонте профиля. Таким образом, Nолиг. была меньше, чем Nсапр.: в первом горизонте в
100, а в остальных четырех – в 1000 раз. Выявленное значительное преобладание
олиготрофов над сапротрофами свидетельствует о том, что в исследованной почве низкое
содержание легкоразлагаемой органики [2], следовательно, данная почва не
подвергалась антропогенному загрязнению. Бактерии функционируют в ней за счет
органического вещества самой почвы. Сапротрофы, развивающиеся в условиях
высокой концентрации органики [3;4], уже переработали ее большую часть. В
настоящее время в исследованной почве доминируют олиготрофы, которым для
существования необходимо низкое содержание органики в среде [2;4].
Интересным
является факт, что для горизонтов с четвертого по пятый отмечаются признаки
оглеения почвы – сизые и голубые пятна и затеки. В настоящее время известны три
совокупные причины глеегенеза [5]: 1) высокая влажность; 2) наличие
легкоразлагаемого органического вещества в избыточном количестве; 3)
жизнедеятельность гетеротрофных микроорганизмов. Согласно нашим результатам,
процесс глеегенеза идет в исследуемой почве при доминировании в микробоценозе
олиготрофных бактерий, а, следовательно, в отсутствие избытка органического
вещества.
Отношение Nсапр. к Nобщ. составило величины
порядка 10-4 – 10-5 (табл.3), что свидетельствует о
климаксном состоянии микробоценоза [3] и о доминировании бактерий, которые
получают необходимые питательные вещества и энергию за счет использования
трудноразлагаемых органических веществ почвы в течение длительного времени.
Таблица
3
Отношение общей
численности к численности сапротрофных бактерий в почвенном профиле дерновой
альфегумусовой глеевой почвы
Горизонты (расположены от верхнего к нижнему)
|
Nсапр.
Nобщ.
|
1.
|
0,5×10-4
|
2.
|
0,6×10-5
|
3.
|
0,4×10-5
|
4.
|
1,0×10-5
|
5.
|
0,4×10-5
|
Примечание: Nсапр. – численность
сапротрофных бактерий (кл/г); Nобщ. – общая численность бактерий (кл/г).
Заключение
1.
Общая
численность бактерий снижается с глубиной залегания почвенного горизонта,
максимальное значение – 6,2×109 кл/г – наблюдается во втором
горизонте за счет того, что два верхних горизонта исследуемой почвы обладают
хорошей проницаемостью для воды и поступающего с ней органического вещества.
2.
Количество
сапротрофных бактерий уменьшалось от первого горизонта к третьему – от
2,5×105 до 1,4×104 кл/г, – причем резкое
снижение численности – более чем в 6 раз (от 2,5×105 до
4,0×104 кл/г) – было отмечено при переходе от первого ко
второму горизонту.
3.
Численность
олиготрофных бактерий последовательно снижалась с увеличением глубины залегания
почвенного горизонта от 9,5×107 в первом до 1,5×107
кл/г в пятом горизонтах.
4.
Отношение
численности олиготрофных бактерий к сапротрофным для первого горизонта
составляет величину порядка 102, а в остальных четырех – 103,
что свидетельствует о значительном преобладании олиготрофов над сапротрофами.
5.
Отношение
численности сапротрофных бактерий к общей численности бактерий составляет величины
порядка 10-4 – 10-5, что свидетельствует о климаксном
состоянии микробоценоза и о доминировании бактерий, жизнедеятельность которых
связана с использованием трудноразлагаемых органических веществ почвы.
6.
Согласно
нашим результатам, процесс глеегенеза идет в исследуемой почве при доминировании
в микробоценозе олиготрофных бактерий, а, следовательно, в отсутствие избытка
органического вещества.
Список использованных
источников и литературы
1. Бабьева И.П. Биология почв / И.П. Бабьева,
Г.М. Зенова. – М.: МГУ, 1989. – 336 с.
2. Емцев В.Т. Микробиология / В.Т. Емцев, Е.Н.
Мишустин. – М.: Дрофа, 2005. – 445 с.
3. Добровольская Т.Г. О показателях структуры
микробных сообществ / Т.Г. Добровольская, И.Ю. Чернов, Д.Г. Звягинцев //
Микробиология. – 1997. – Т.66. – №3. – С. 408–414.
4. Заварзин Г.А. Введение в природоведческую микробиологию
/ Г.А. Заварзин, Н.Т. Колотилова. – М.: Книжный дом «Университет», 2001. – 256 с.
5. Зайдельман, Ф.Р. Процесс глееобразования и его
роль в формировании почв / Ф.Р. Зайдельман. – М.: МГУ, 1998. – 316 с.
6. Кузнецов С.И. Методы изучения водных микроорганизмов
/ С.И. Кузнецов, Г.А. Дубинина. – М.: Наука, 1989. – 288 с.
7. Практикум по микробиологии / Под ред. Н.С.
Егорова. – М: МГУ, 1976. – 307 с.
8. Соединения железа, алюминия, кремния и
марганца в почвах лесных экосистем таежной зоны / М. Мурашкина, Г. Копцик, и
др. // Почвоведение. – 2004. – № 1. – С. 40– 49.
9. Умаров М.М. Экология и почвы / М.М. Умаров.
Избранные лекции 1–7 школ, М.: Пущино, 1998, 15–21 с.
10. Экология микроорганизмов: учебник / А. И.
Нетрусов, Е.А. Бонч - Осмоловская, и др. – М.: Издательский центр «Академия»,
2004. – 272с.
11. Hottes A.K. Transcriptional profiling
of Caulobacter crescentus during growth on complex and minimal media / A.K.
Hottes, M. McEwen, D. Yang et al. // J. Bacteriol. – 2004. – V. 186. – №5. – P.
1448–1461.
|